Material y Métodos. Dos cadáveres de cerdo fueron expuestos en un bosque premontano húmedo tropical. A partir de dichos cadáveres se colectaron larvas de L. eximia a las 78, 144 y 192 horas posteriores al momento de muerte y se propició su desarrollo en condiciones controladas. Con los datos generados, se realizaron retroproyecciones térmicas para efectuar el cálculo del IPM.

Resultados. L. eximia requirió en total 7 236,50 grados-hora acumulados (ADH) para culminar su desarrollo. Los IPM calculados mediante el modelo de acumulación térmica para los tres momentos de colecta fueron 112,56; 153,60 y 104,64 horas. Únicamente el valor intermedio no presentó diferencias estadísticamente significativas con el tiempo de muerte conocido (p>0.05).

Conclusiones. El modelo de acumulación térmica en que se utilizó L. eximia brindó información precisa sobre el IPM sólo cuando se tomaron las muestras en el campo a las 144 horas, lo que perfila su utilidad para las primeras etapas de la descomposición cadavérica.

Introducción

Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae) es una especie común en los trópicos de América, y en Costa Rica es considerada un muscomorfo de amplia distribución a lo largo del territorio nacional (1). Un estudio sobre sucesión entomológica en el que se utilizaron cadáveres de conejos mostró que las poblaciones de L. eximia se mantuvieron estables durante todo el año en la zona del estudio. Dicho estudio fue efectuado en un bosque premontano húmedo tropical en el centro del país (2). En relación con lo anterior, es plausible considerar a L. eximia como una especie de utilidad para análisis entomológicos forenses en Costa Rica (2).

Uno de los mayores aportes de la entomología forense a las investigaciones periciales, es el cálculo del intervalo post mortem mínimo (IPM), el cual consiste en el período circunscrito por el momento de muerte y el hallazgo del cadáver respectivo (3,4). El cálculo del IPM basado en el conocimiento biológico de especies de insectos afines a cuerpos en descomposición resulta útil cuando las estimaciones basadas en criterios patológicos son infructuosas (5). Esto ocurre especialmente cuando los cadáveres se encuentran en estado avanzado de descomposición, situación que dificulta al patólogo forense estimar las causas y el tiempo de muerte (5).

En el contexto de la investigación forense, los análisis entomológicos son considerados las opciones que brindan la mejor precisión en la estimación del tiempo de muerte después de 72 horas del deceso (4,6-10). De los distintos modelos a los que se puede recurrir para obtener esta información, el método basado en la acumulación térmica, mediante el cálculo de grados-hora acumulados (ADH, por sus siglas en inglés de accumulated degree hours), es uno de los más utilizados. Este representa una estimación de la inversión energética requerida en el ciclo de desarrollo por parte del insecto (7,9,11). Para aplicar este método, es necesario disponer de datos inherentes a la especie o especies halladas en el cadáver que constituyen indicadores forenses. Dentro de estos figuran la temperatura óptima para el desarrollo de los estadios, la duración de estos a dicha temperatura, la temperatura base, así como los datos de temperatura de la estación meteorológica más cercana a la ubicación del cadáver (9).

También, se han descrito modelos matemáticos que, en comparación con el modelo convencional de acumulación térmica, figuran como herramientas opcionales en el cálculo del IPM. Dentro de estos, cabe destacar el modelo propuesto por Reibe y colaboradores, que fue diseñado para incluir incertidumbres relativas a las temperaturas de la escena del crimen (12). También debe mencionarse el modelo matemático predictivo de Chua, basado en temperaturas tomadas cada media hora para calcular posteriormente un IPM basado en ellas (13).

Material y Métodos

Estudios de laboratorio para el cálculo de la inversión térmica. El presente estudio fue aprobado por el Comité Institucional del Cuido y Uso de Animales (CICUA) de la Universidad de Costa Rica. Para generar la información base sobre la inversión térmica relativa a los cambios de fase, se trabajó de forma simultánea a partir de cinco oviposturas, cuyo promedio de huevos fue de 334±114 (15). Los huevos correspondientes a cada ovipostura fueron obtenidos a partir de una colonia de L. eximia previamente establecida y mantenida en el laboratorio según procedimientos descritos por Belfort y fueron colocados sobre hígado de res para propiciar su eclosión (16). Los estadios inmaduros, obtenidos a partir de estos huevos, fueron criados hasta el estadio adulto. Se utilizó hígado de res como sustrato alimenticio. Las condiciones de crianza fueron preestablecidas en una cámara aclimatadora Darwin Chambers Company© modelo INO 34 e incluyeron una temperatura controlada de 28°C ± 2°C, humedad relativa del 100% y fotoperiodo de 12 horas. Posteriormente, se registró el tiempo que tardó la mitad de los huevos, correspondiente a cada ovipostura, en eclosionar y la misma proporción de larvas en experimentar cada cambio de fase hasta el estadio adulto. Las observaciones se efectuaron entre las 6 y las 19 horas, en intervalos de 1 a 2 horas para los primeros tres estadios, a saber, huevo (H), larva de primer estadio (L1) y larva de segundo estadio (L2) y de 2 a 5 horas los estadios restantes: larva de tercer estadio (L3) y pupa (P). Para precisar los cambios morfológicos inherentes a cada estadio, se observaron las hendiduras respiratorias de los espiráculos posteriores de las larvas y la formación del pupario en el caso de la pupa. El ciclo fue repetido hasta obtener los datos para cada cambio de fase, al menos por sextuplicado. Con esta información, se calculó la inversión de ADH requeridas para el correspondiente cambio de fase, según el procedimiento descrito por Gennard (9). Para el cálculo se utilizó una temperatura base de 8°C, determinada de forma previa, tras realizar ensayos de desarrollo a 4°C, 6°C y 8°C.

Cadáveres. Dos cadáveres de cerdo (Sus scrofa) de 9,8 y 5,9 kg, sacrificados mediante protocolos de inyección endovenosa con cloruro de potasio (2 mmol/Kg de peso) (17), fueron expuestos en un ambiente de bosque premontano húmedo tropical, representado por la Reserva Biológica Leonel Oviedo, en la Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Universidad de Costa Rica, San José Costa Rica (9°56′09″N y 84°03′02″O). El ambiente de dicha reserva corresponde a un bosque premontano húmedo tropical, cuya precipitación, humedad y temperatura promedio en la estación lluviosa (mayo-noviembre) son 245,5 mm, 85,1% y 20,2ºC respectivamente (18). El deceso de los animales ocurrió a las 9 horas y los cadáveres fueron protegidos de carroñeros mediante la colocación de una jaula de cedazo, cuyas dimensiones fueron de 80 x 30 x 25 cm (Figura 1).

Figura 1. Cadáver de cerdo expuesto en bosque premontano húmedo tropical. San José, Costa Rica.

Procesamiento del material entomológico. Considerando los procesos de toma de muestras en análisis forenses reales, a partir de cada cadáver, se realizaron colectas de masas larvales presentes en orificios naturales y otras localizaciones a las 78, 144 y 192 horas después de la muerte. Los especímenes larvales emergentes que correspondieron a L. eximia (19), fueron criados en el laboratorio, en hígado de res, bajo las mismas condiciones previamente descritas. Para cada larva se registró el tiempo requerido para que tuviese lugar el cambio de fase próximo. Las observaciones en el caso de las larvas se realizaron dos veces por día, aproximadamente cada 10 horas. Para las pupas, las observaciones se realizaron cada 24 horas. La identidad de especie del imago resultante se corroboró según claves dicotómicas especializadas (1,20). Los datos relativos a imagos cuya morfología fue diferente a la de L. eximia fueron descartados del estudio. Posteriormente, se calculó para las muestras de L. eximia, el número de ADH correspondiente para el cambio de fase. Se registró, además, la identificación a nivel de especie, de los califóridos que no correspondieron a L. eximia.

De forma paralela a la exposición de los cadáveres, se registró la temperatura ambiente durante cada hora por cinco días. Para esto, se colocó una miniestación meteorológica básica Davis Instruments Vantage Pro 6150C en el sitio de estudio. Los datos se exportaron a una hoja electrónica para su trabajo en Microsoft Excel. También, durante la ejecución del estudio se obtuvo la información generada por la estación meteorológica más cercana, ubicada a 1,3 km de la reserva, que pertenece al Centro de Investigaciones Geofísicas (CIGEFI) de la Universidad de Costa Rica.

Análisis de los datos. A partir de los datos de temperatura obtenidos se generó la ecuación de regresión lineal: y = 0,7758x + 4,2426; donde (x) fue la temperatura proporcionada por el CIGEFI y (y) la temperatura en la ubicación de los cadáveres. Se realizó un análisis retrospectivo según el procedimiento descrito por Gennard (9) y se estimó el IPM para cada grupo larval. El modelo de retroproyección consistió en calcular las ADH que debieron ser invertidas desde la ovipostura hasta el momento de la colecta de las muestras. Esto se hizo de acuerdo con la información conocida de la inversión de ADH de las etapas del ciclo de vida de L. eximia y la información obtenida en el tercer apartado. Posteriormente se efectuó un análisis retrospectivo, en el que se descontaron los ADH considerando la temperatura de cada hora, hasta estimar el IPM que debió haber coincidido con el momento de la oviposición. Se hizo un análisis de distribución de las variables y se constató que se cumplía con las características de una distribución normal. El análisis comparativo de los IPM calculados con sus respectivos tiempos conocidos de muerte, se hizo mediante pruebas de t-Student con una confiabilidad del 95%, a: 0,05. Se empleó el paquete estadístico SPSS versión 11.5.0 (21).

Resultados

Bajo las condiciones experimentales del presente estudio, L. eximia requirió un promedio de 7.236,50 ADH para culminar su ciclo vital (cuadro 1). El consumo energético de los estadios de huevo (225,50±4,10 ADH), L1 (235,75±37,10 ADH) y L2 (235,75±30,14 ADH) fue similar entre ellos, e individualmente fueron menos de la décima parte del requerimiento energético de L3 (3157,00±715,65 ADH) y pupa (3382,50±371,25 ADH); este último estadio conllevó el mayor consumo energético (cuadro 1).

Cuadro 1. Inversión energética en unidades de acumulación térmica (horas grado acumulado, ADH), y duración en horas para los estadios del ciclo de vida de L. eximia (Diptera: Calliphoridae) a 28,5ºC y 100% humedad relativa, temperatura base 8°C.

a Masas de huevos

Cuadro 2. Otras especies de califóridos colectados en masas larvales en el contexto del muestreo de L. eximia en dos cadáveres de cerdo.

*Se considera número total de días en que se colectaron califóridos

Cuadro 3. Datos correspondientes al análisis de la precisión del cálculo del IPM basado en unidades térmicas (horas grado acumulado, ADH) utilizando L. eximia como indicador forense.

Discusión

En Costa Rica la riqueza de especies de califóridos es manifiesta (2), por lo que el hallazgo de diferentes especies de esta familia en el presente estudio era esperable (Cuadro 2). No obstante, la abundancia y distribución territorial de L. eximia, permiten visualizar a esta especie como indicador para diferentes tipos de análisis entomológico-forenses. En el cálculo del IPM utilizando a L. eximia, se pudo observar que hubo diferencias estadísticamente significativas entre el tiempo conocido de muerte y el IPM calculado cuando se tomaron muestras a las 78 y 192 horas post mortem (p=0,002 y p=0,000 respectivamente). No obstante, cuando las muestras fueron colectadas a las 144 horas, el IPM no tuvo diferencias significativas con el tiempo de muerte real. La inexactitud observada en dicho cálculo en muestras colectadas a las 78 y 192 horas post mortem pudo tener varios orígenes. Para algunos autores, la medición de la temperatura representa el principal factor limitante en la estimación del IPM bajo la metodología ejecutada, ya que los valores corregidos de las mismas aún contienen incertidumbres que no pueden ser explicadas por los modelos que actualmente se utilizan para la determinación del IPM (12,22). Además, las fuentes de error pueden provenir de la variabilidad inherente de los individuos de la muestra larval, de los instrumentos utilizados para la medición y del tamaño de la muestra (11).

Con respecto a la temperatura de la masa larval, se sabe que ésta añade una subestimación importante al cálculo del IPM (3); sin embargo, no se han definido criterios estandarizados sobre cómo abordar esta variable en los modelos de cálculo, por lo que se recomienda registrar las temperaturas larvales incluso en ambientes controlados y de esta forma mejorar la precisión de la medición del modelo de acumulación térmica (3,11,23). Es posible que la principal razón de la disparidad mostrada por el cálculo del IPM correspondiente a las 192 horas post mortem, fuera la presencia de progenies escalonadas de estadios inmaduros en los cadáveres (3). Esta idea se refuerza al considerar los datos del desarrollo de L. eximia (cuadro 1) y las temperaturas registradas, de modo que se colectaron especímenes del tercer estadio, pero de distintas progenies. De ser cierta, esta posibilidad implica un mayor requerimiento energético en la incubación por parte de las progenies más nuevas y con ello una imprecisión con tendencia a la disminución en el IPM calculado. Adicionalmente, es posible que a falta de un sustrato adecuado de oviposición, las hembras silvestres retengan los huevos y estos experimenten su desarrollo embrionario en cierto grado (24). Este fenómeno se ha observado en algunos califóridos como Lucilia sericata, pudiendo darse un período de retención tan prolongado como el total de la duración del desarrollo embrionario, lo que implicaría una subestimación en el IPM calculado (11).

El cálculo del IPM correspondiente a las 144 horas post mortem fue el menos afectado. La ubicación temporal de la colecta de estas larvas aminoró el error inducido por la variabilidad asociada con los tiempos de ovipostura. Aunque las larvas provinieran de distintas progenies, la diferencia entre sus tiempos de ovipostura pudo ser mínima. De esta forma no se afectó significativamente el cálculo del IPM. Con respecto a la confiabilidad del cálculo del IPM mediante el modelo de acumulación térmica, Reibe y colaboradores plantean que para ninguno de los modelos utilizados en el cálculo del IPM existe información sobre la calidad del método o los intervalos de error del IPM calculado (12). Estos autores proponen un método basado en el desarrollo real no lineal de L. sericata, diseñado para incluir incertidumbres, tales como las temperaturas de la escena del crimen. En un ejercicio en el que compararon su modelo con el de acumulación térmica obtuvieron resultados muy similares; sin embargo, concluyen que el IPM basado en promedios de temperaturas puede llevar a desviaciones severas respecto al tiempo de muerte real. Recientemente, Chua realizó un análisis similar con seis casos en Malasia, en donde comparó el IPM obtenido utilizando un modelo matemático predictivo de temperaturas de cada media hora, contra el IPM obtenido por retroproyección térmica utilizando temperaturas del aire (13). Este autor encontró sólo diferencias mínimas y expone que el cálculo del IPM por este método es aceptable, aunque se utilice un promedio diario de temperaturas para realizar el cálculo de los ADD (13). Ambos estudios parecen ser congruentes en cuanto al análisis de los factores que influyen en la precisión del cálculo del IPM, especialmente la temperatura; no obstante, los resultados de Chua apuntan hacia una mayor confiabilidad en el cálculo del IPM por acumulación térmica, minimizando la severidad con que Reibe y colaboradores cuestionan las limitaciones de dicho método (12,13). Es importante destacar que esta metodología ha sido empleada en el peritaje de casos forenses en diferentes lugares y cada vez es más aceptada en el ámbito judicial (25-27).

Por último, el departamento de policía de Rio de Janeiro, durante el desarrollo de algunas investigaciones de homicidios donde se utilizó un modelo de retroproyección térmica para estimar el IPM, consideró el periodo entre la muerte y la colonización del cadáver por dípteros igual a 12 horas (26). Partiendo de esta premisa, la diferencia entre el IPM calculado para las 78 horas post mortem en el presente estudio y el valor verdadero sería menor a un día (22,56 horas) (cuadro 3). Por lo tanto, la evidencia indica que el modelo de acumulación térmica planteado y el indicador forense utilizado, son confiables para estimar el IPM durante las primeras etapas de descomposición cadavérica. En estas fases, la escasa presencia de progenies escalonadas no alteraría de forma significativa el resultado del cálculo. Además, del análisis multifactorial enfocado en las fuentes de error que se han descrito para este tipo de estudios, se desprende la conclusión de que el análisis entomológico-forense debe realizarse de una manera muy cuidadosa y detallista, con base en el conocimiento acumulado sobre dicha disciplina, con el fin de validar su utilidad pericial en cada caso. Con el fin de optimizar la calidad de los análisis es conveniente prever las mejores condiciones de trabajo, tanto de equipamiento del laboratorio como en la capacitación de especialistas y metodologías utilizadas (27); y de esta forma procurar la disminución de errores en el cálculo del IPM.

Agradecimientos

Los autores desean externar su agradecimiento al Lic. John Vargas Fonseca por su labor de revisión del documento; a la Granja Ochomogo de Turrúcares, Alajuela, por la donación de los cerdos utilizados; al Dr. José Francisco Di Stefáno, coordinador de la Reserva Leonel Oviedo, por sus sugerencias respecto al estudio; a José Luis Vargas del Centro de Investigaciones Geofísicas (CIGEFI) por su capacitación en la utilización de la mini estación meteorológica; a Katherine Salazar Zeledón e Iván Coronado del Laboratorio de Investigación en Vectores (LIVE) por su apoyo en el procesamiento de muestras y a la Vicerrectoría de Acción Social, Universidad de Costa Rica, por apoyo al proyecto ED-548.

Referencias